酶活性检测:科学分析酶功能的核心方法
概括
酶活性是指酶在催化生化反应时的效率,通常由单位时间内酶催化反应的底物转化速率来衡量。酶是生物体内催化化学反应的重要蛋白质,广泛应用于医学诊断、食品工业、环境保护等领域。通过准确检测酶活性,可以揭示酶在生物体内的功能状态,进而提供疾病预警、过程优化和质量控制的科学依据。
检测样品
酶活性检测的样品来源广泛,包括但不限于以下几类:
- 血液样本:用于检测体内酶的活动水平,如肝酶、心肌酶等。
- 组织提取物:从动植物组织中提取的酶溶液。
- 细胞培养液:通过培养细胞后提取的培养液,用于检测特定酶的表达和活性。
- 土壤和水样:常用于环境监测,检测土壤或水体中微生物酶的活性。
检测项目
酶活性检测涉及多个关键项目,主要包括:
- 酶活性测定:定量分析样品中酶的活性水平,通常以单位时间内底物转化的量来表示。
- 酶动力学分析:测定酶的最大反应速度(Vmax)和米氏常数(Km),评估酶的催化效率。
- 温度与pH适应性:测试酶活性在不同温度和pH条件下的变化,帮助了解酶的稳定性和最适工作环境。
- 抑制与激活分析:检测特定化学物质对酶活性的抑制或激活效果。
检测仪器
为了准确测定酶活性,常用的检测仪器包括:
- 分光光度计:通过测量反应产物的吸光度变化来评估酶的活性,常见于酶催化的光学反应。
- 荧光分析仪:利用荧光信号变化来检测酶反应过程中的底物转化。
- 酶标仪:多用于96孔板格式的酶活性测定,可以同时进行高通量筛选。
- 气相色谱仪和液相色谱仪:适用于分析酶反应后产生的气体或溶解产物,帮助分析酶的催化效率。
检测方法
酶活性检测方法通常包括以下几种:
- 比色法:通过反应产物的颜色变化来定量测定酶活性。例如,使用酶反应生成有色化合物,通过分光光度计读取吸光度。
- 荧光法:采用荧光标记底物或产物,通过荧光强度变化监测酶反应。
- 放射性同位素标记法:通过标记底物或产物的放射性进行酶活性测定,灵敏度高,但使用时需严格控制放射性物质。
- 高效液相色谱法(HPLC):可用于分离酶反应产物,结合UV检测实现酶活性的高精度测定。
检测标准(部分)
《 T/JAASS 144-2024 土壤微生物胞外酶活性测定 荧光法 》标准简介
- 标准名称:土壤微生物胞外酶活性测定 荧光法
- 标准号:T/JAASS 144-2024
- 中国标准分类号:B10/A019
- 发布日期:2024-06-24
- 国际标准分类号:65.020.99
- 实施日期:2024-07-24
- 团体名称:江苏省农学会
- 标准分类:农业A 农、林、牧、渔业
- 内容简介:
本文件适用于使用微孔荧光法检测土壤中与碳、氮、磷循环相关的关键水解酶活性,且酶底物荧光指示剂需是4-甲基伞形酮或7-氨基-4-甲基香豆素
本文件描述了土壤微生物胞外酶活性利用微孔荧光法的测定方法。
《 T/NAIA 0279-2024 土壤中蛋白酶活性的测定 》标准简介
- 标准名称:土壤中蛋白酶活性的测定
- 标准号:T/NAIA 0279-2024
- 中国标准分类号:A019
- 发布日期:2024-01-25
- 国际标准分类号:65.020.01
- 实施日期:2024-01-31
- 团体名称:宁夏化学分析测试协会
- 标准分类:农业A 农、林、牧、渔业
- 内容简介:
本文件规定了土壤中蛋白酶活性的测定方法。本文件适用于土壤中蛋白酶活性的测定。
《 T/CSTM 01090-2022 乙酰胆碱酯酶 活性检测 分光光度法 》标准简介
- 标准名称:乙酰胆碱酯酶 活性检测 分光光度法
- 标准号:T/CSTM 01090-2022
- 中国标准分类号:G66/C266
- 发布日期:2022-10-28
- 国际标准分类号:71.040.30
- 实施日期:2023-01-28
- 团体名称:中关村材料试验技术联盟
- 标准分类:G 交通运输、仓储和邮政业化工技术
- 内容简介:
本文件规定了用分光光度法测定乙酰胆碱酯酶活性的方法本文件适用于有机磷与氨基甲酸酯类农药残留检测专用试剂中乙酰胆碱酯酶活性的测定,本方法定量限为0.01μmol/(mL·min),测量范围为0.01μmol/(mL·min)~0.13μmol/(mL·min)本文件规定了用分光光度法测定乙酰胆碱酯酶活性的方法
本文件适用于有机磷与氨基甲酸酯类农药残留检测专用试剂中乙酰胆碱酯酶活性的测定,本方法定量限为0.01μmol/(mL·min),测量范围为0.01μmol/(mL·min)~0.13μmol/(mL·min)
《 T/CAIA SHO19-2022 乙酰胆碱酯酶 活性检测 分光光度法 》标准简介
- 标准名称:乙酰胆碱酯酶 活性检测 分光光度法
- 标准号:T/CAIA SHO19-2022
- 中国标准分类号:M733
- 发布日期:2022-10-25
- 国际标准分类号:67.050
- 实施日期:2022-12-01
- 团体名称:中国分析测试协会
- 标准分类:M 科学研究和技术服务业食品技术
- 内容简介:
乙酰胆碱酯酶能水解碘化硫代乙酰胆碱生成硫代胆碱和乙酸
硫代胆碱与巯基显色剂5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应生成黄色化合物5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNB),TNB在波长412nm处有特征性光吸收,测定其吸光度值;根据还原型谷胱甘肽制备标准溶液与DTNB反应,所绘制谷胱甘肽的量与吸光度关系的标准曲线,计算出乙酰胆碱酯酶的酶活性值
《 T/CIFST 008-2022 乳中乳过氧化物酶活性的测定 比色法 》标准简介
- 标准名称:乳中乳过氧化物酶活性的测定 比色法
- 标准号:T/CIFST 008-2022
- 中国标准分类号:C139
- 发布日期:2022-04-22
- 国际标准分类号:67.040
- 实施日期:2022-04-22
- 团体名称:中国食品科学技术学会
- 标准分类:C 制造业食品技术
- 内容简介:
本文件规定了乳中乳过氧化物酶活性测定的比色法
本文件适用于生乳、巴氏杀菌乳中乳过氧化物酶活性的测定
《 T/SHRH 015-2018 化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验方法 》标准简介
- 标准名称:化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验方法
- 标准号:T/SHRH 015-2018
- 中国标准分类号:Y42/C268
- 发布日期:2018-12-01
- 国际标准分类号:71.100.70
- 实施日期:2018-12-30
- 团体名称:上海日用化学品行业协会
- 标准分类:C 制造业化工技术
- 内容简介:
1.范围2.原理3.仪器4.试剂5实验方法6.结果计算7.试验有效性验证8.结果报告
《 T/GDCA 006-2021 化妆品原料对酪氨酸酶活性抑制试验方法 (体外法) 》标准简介
- 标准名称:化妆品原料对酪氨酸酶活性抑制试验方法 (体外法)
- 标准号:T/GDCA 006-2021
- 中国标准分类号:C268
- 发布日期:2021-10-29
- 国际标准分类号:71.100.70
- 实施日期:2021-11-30
- 团体名称:广东省化妆品学会
- 标准分类:C 制造业化工技术
- 内容简介:
本文件规定了一种体外酪氨酸酶活性抑制试验方法本文件适用于通过抑制酪氨酸酶活性而达到美白效果的化妆品水溶性原料的功效测试1.实验方法除非另有说明,本文件所提到的受试样品的浓度均指其配制时的浓度
1.1受试物处理阳性对照曲酸用PBS缓冲液稀释成:0.080g/L、0.040g/L、0.020g/L、0.010g/L、0.008g/L、0.005g/L、0.002g/L、0.001g/L系列质量浓度梯度溶液
受试物处理:受试物用PBS缓冲液梯度稀释成5个以上合适质量浓度的样品溶液
1.2试验分组在96孔酶标板中设置溶剂本底孔(Ta)、溶剂反应孔(Tb)、样品本底孔(Tc)、样品反应孔(Td)
其中,Ta组为溶剂本底组,不加底物L-酪氨酸溶液、不加样品溶液;Tb组为溶剂反应组,加底物L-酪氨酸溶液但不加样品溶液;Tc组为样品本底组,不加底物L-酪氨酸溶液、加样品溶液;Td组为样品反应组,既加底物L-酪氨酸溶液又加样品溶液
每组做三个复孔
1.3试验步骤参照表1试剂添加量,在各孔依次加入L-酪氨酸溶液、样品溶液/溶剂、PBS缓冲液,充分混匀,置于37℃恒温环境下孵育10min后依次在各孔加入20μL的酪氨酸酶溶液,37℃混匀反应5min±5s后即刻放入酶标仪,在475nm波长处进行测定
注:各孔从加入酪氨酸酶溶液到测定吸光度,保持时间一致(5min±5s)
2.结果计算2.1酪氨酸酶活性抑制率2.2半数抑制浓度(IC50值)以受试样品的浓度为横坐标,其对应的酪氨酸酶抑制率为纵坐标,绘制曲线图,拟合得到回归方程(R2≥0.9)
根据回归方程,计算酪氨酸酶抑制率为50%时对应的样品浓度,即为该受试样品的IC50值,同时计算其95%置信区间
2.3曲酸当量值3.试验有效性验证每批次实验都需要加入阳性对照的测试,阳性对照曲酸的IC50应在0.005g/L~0.03g/L,则认为试验系统有效
各组平行孔间的抑制率间的标准差(StandardDeviation,SD)值需≤15%,则认为试验平行性有效
加入酪氨酸酶溶液,37℃混匀反应5min±5s后即刻放入酶标仪,在475nm波长处进行测定:±5s时间对测试结果IC50的影响,标准差SD值≤3%
4.结果判定样品在某一受试浓度下的酪氨酸酶抑制率应表述为:抑制率平均值±抑制率间的标准差(SD)
进行不同样品的酪氨酸酶抑制能力比较,在同一受试浓度下,抑制率越大代表该样品的酪氨酸酶抑制能力越强
进行不同样品的酪氨酸酶抑制能力比较,IC50值越小代表该样品的酪氨酸酶抑制能力越强
进行不同样品的酪氨酸酶抑制能力比较,曲酸当量值越小代表该样品的酪氨酸酶抑制能力越强
《 DB41/T 1615-2018 食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程 》标准简介
- 标准名称:食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程
- 标准号:DB41/T 1615-2018
- 中国标准分类号:B05
- 发布日期:2018-06-19
- 国际标准分类号:65.020.20
- 实施日期:2018-09-19
- 技术归口:
- 代替标准:
- 主管部门:河南省质量技术监督局
- 标准分类:农业农、林、牧、渔业河南省
- 内容简介:
地方标准《食用菌纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活性检测技术规程》,主管部门为河南省质量技术监督局。
《 DB34/T 1729-2012 窖泥中脱氢酶活性的分析方法 》标准简介
- 标准名称:窖泥中脱氢酶活性的分析方法
- 标准号:DB34/T 1729-2012
- 中国标准分类号:X00
- 发布日期:2012-11-06
- 国际标准分类号:67.040
- 实施日期:2012-12-06
- 技术归口:安徽省浓香型白酒标准化技术委员会
- 代替标准:
- 主管部门:安徽省质量技术监督局
- 标准分类:食品技术制造业安徽省食品综合
- 内容简介:
地方标准《窖泥中脱氢酶活性的分析方法》由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会归口上报,主管部门为安徽省质量技术监督局。本标准规定了窖泥中脱氢酶活性的分析方法。本标准适用于浓香型白酒窖泥中脱氢酶活性的分析。
《 SN/T 0800.4-2015 出口粮食、饲料检验 第4部分:尿素酶活性测定方法 》标准简介
- 标准名称:出口粮食、饲料检验 第4部分:尿素酶活性测定方法
- 标准号:SN/T 0800.4-2015
- 中国标准分类号:B20
- 发布日期:2015-12-04
- 国际标准分类号:67.050
- 实施日期:2016-07-01
- 技术归口:国家认证认可监督管理委员会
- 代替标准:代替SN/T 0800.4-1999
- 主管部门:国家质量监督检验检疫总局
- 标准分类:食品技术食品试验和分析的一般方法制造业SN 出入境检验检疫
- 内容简介:
行业标准《出口粮食、饲料检验 第4部分:尿素酶活性测定方法》由国家认证认可监督管理委员会归口上报,主管部门为国家质量监督检验检疫总局。SN/T0800的本部分规定了尿素酶活性的测定方法。本部分适用于出口粮食、饲料用大豆粕、饼、粉等大豆制品中尿素酶活性的测定。
《 WS/T 222-2002 临床酶活性浓度测定方法总则 》标准简介
- 标准名称:临床酶活性浓度测定方法总则
- 标准号:WS/T 222-2002
- 中国标准分类号:C50
- 发布日期:2002-04-20
- 国际标准分类号:13.020
- 实施日期:2002-07-01
- 技术归口:
- 代替标准:
- 主管部门:卫生部
- 标准分类:环保、保健和安全医药卫生技术医学科学和保健装置综合WS 卫生
- 内容简介:
行业标准《临床酶活性浓度测定方法总则》,主管部门为卫生部。本标准规定了临床酶活性浓度测定方法总则。本标准适用于临床与基础医学实验室进行酶活性浓度的测定,也可作为与酶活性浓度检验有关的仪器和试剂生产企业、有关评价单位及质量管理部门的标准。
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结语
酶活性检测是一项重要的生物学实验技术,广泛应用于生命科学研究、临床诊断以及工业生产中。通过精确的检测和分析,可以帮助科研人员更好地理解酶的功能和机制,推动相关领域的发展。在选择检测方法时,研究人员应根据实验目标、样品特性和仪器设备的可用性,选择合适的检测方案,以确保检测结果的准确性和可靠性。
结语
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